DNA提取原则：
1.保证DNA一级结构的完整性。
2.提取的DNA样品中不应存在对酶存在抑制作用的有机溶剂及过高浓度的金属离子。
3.其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度。
4.排除其它核酸分子（如采集者身上的RNA、DNA）的污染。
提取环境DNA所用的试剂盒为DNeasy® PowerSoil® Pro Kit：
试剂盒中含有PowerBead Pro管、2 mL微量离心管、1.5 mL洗脱管、MB吸附柱、2 mL收集管、CD1、CD2、CD3溶液、C5、C6溶液、EA溶液。
该试剂盒是土壤中DNA提取专用试剂盒，可以提取其他物质的DNA（如鱼肉、海水、粪便），但对除土壤外的DNA特异性吸附效果不佳，因此提取DNA时应采用对应试剂盒。
DNA片段纯化所用的试剂盒为TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0。
试剂盒中含有分离柱、收集管、2 mL微量离心管、1.5 mL洗脱管、MB缓冲液、DC缓冲液、洗脱缓冲液。
样品的名字或编号一般会比较长，实验中会进行多次的更换容器的操作，为简化操作和方便记忆建议将样品先进行编号（如A1、A2、B1、B2）后再进行后续实验。
实验开始前需要用次氯酸溶液和70 %乙醇溶液擦拭桌面和手套，防止外源DNA在实验过程中对样品的污染。
流程：
1.样品采集
环境DNA的样品来源广泛，可以是水样、土壤样、沉积物，甚至是动物粪便。比如在野外采集河流、湿地或海洋的水样，或是采集沉积物和粪便（如海狸、欧亚水獭的粪便），这些都可以作为环境DNA的来源。也可以直接采集植物或者动物的组织但需要加入Buffer进行研磨将细胞裂解。
采样前通常要准备空白对照（Blank），确保没有实验室或设备的污染。常规的采样次数一般是三次重复采样也可以做更多的重复，这样能确保结果的代表性和准确性。采集水样时，可以先将样品用滤膜过滤，水中的颗粒物会被收集在滤膜上这些滤膜之后会被处理用于提取DNA。
2.样品前处理
（1）称量样品：称取250 mg的土壤样本加入到试剂盒提供的PowerBead Pro管中，可以直接称取在PowerBead Pro管盖上，后直接盖上盖子将样品装进管中，可减少误差。（250 mg是最少样品量，为保证实验的成功也可以多称取一些样品进行提取，本次实验中称取的样品量为300 mg。称取样品前可以先向PowerBead Pro 管中加入CD1溶液混匀后再加入样品。）
（2）加入试剂和震荡处理：向装有土壤样本的PowerBead Pro管中加入800 µL的CD1溶液，简短地涡旋混合。将PowerBead Pro管水平固定在1.5-2 mL管的涡旋适配器上（产品编号13000-V1-24）。以最大速度涡旋10 min。若使用涡旋适配器同时处理超过12个样品，则应将涡旋时间增加5-10 min。（PowerBead Pro管中含有特殊的研磨珠与样品和CD1溶液混合后涡旋振荡可以破坏细胞结构将DNA释放出来并防止其被分解。）
3.DNA提取
（1）将涡旋后的PowerBead Pro管放入离心机中以15000 g离心1 min。
（2）离心结束后将PowerBead Pro管中的上清液转移到干净的2 mL微量离心管中。（预计可以得到500-600 µL的液体。上清液中可能含有一些土壤颗粒但不影响后续的实验。）
（3）向离心管中加入200 µL的CD2溶液，并涡旋5 sec。
（4）将离心管在室温下以15000 g离心1 min。在避免沉淀的情况下尽可能多地转移上清液到干净2 mL微量离心管中。（预计可以得到500-600 µL的液体。）
（5）再向离心管中加入600 µL的CD3溶液并涡旋5 sec。（涡旋之后应该进行一部简单的离心，去除盖子和管壁上残留的液体并将其富集在离心管底部。以上反复离心涡旋的步骤是为了使DNA裂解出来。）
（6）将650 µL的溶液加入MB分离柱，并以15000 g离心1 min。（可以将全部液体都转移，MB分离柱的容量不够大可以多次加入液体并离心。实验中将液体全部转移，先转移一部分进入MB分离柱中进行离心，离心完成后将收集管中的液体再次加入MB分离柱中离心。将第二次离心后收集管中的液体遗弃，再加入另一部分的液体进入MB分离柱中重复上述操作，确保液体全部通过MB分离柱中的滤膜，并收集到裂解出的DNA。）
（7）小心地将MB分离柱放入干净的2 mL收集管，避免流出液溅到MB分离柱上造成污染。
（8）向MB分离柱中加入500 µL的EA溶液，并以15000 g离心1 min。
（9）离心结束后遗弃收集管中流出液，并将MB分离柱放回相同的2 mL收集管中，并加入500 µL的C5溶液以15000 g离心1 min。
（10）离心结束后遗弃收集管中流出液，并将MB分离柱转移至新的2 mL收集管中，以16000 g离心2 min。小心地将MB分离柱放入新的1.5 mL洗脱管中。
（11）离心结束后将50-100 µL的C6溶液加入白色滤膜的中心，以15000 g离心1 min后丢弃MB分离柱，此时提取到的DNA可以进行后续的PCR检测。（（7）-（11）本质上是对提取出来的DNA进行反复的洗涤，有些条件可以根据实际情况改变，如加入的EA和C5溶液可以适量增加一些，离心的转速也可以增加一些，也可以用无水乙醇进行洗涤，但每次洗涤后最好开盖平衡一下气压，让乙醇更快挥发。每次离心完成倒掉收集管中的液体后可以用纸将收集管口的液体擦干净防止这些液体污染分离柱。在对离心管等容器反复开关盖后可以先进行简单的离心，将粘在盖上的液体和盖子分离并与管内的液体混匀。在最后一步洗涤时将洗涤剂加热至65 ℃并分为两次进行洗涤这样的洗涤效果更好，也可以用纯水洗涤，但相对于洗涤剂没有抑制剂保护DNA。）
4.PCR扩增材料准备
准备的材料包括DNA、缓冲液、纯水、引物和原料。反应体系为25 µL，每个样品需要做3个重复，6组样品需要做18个反应，3个八连管。向管中加入1 µL的DNA模版、1 µL引物和适量的原料，并用纯水补足到25 µL。材料准备完毕后即可开始PCR扩增。（引物分为前引物和后引物，各加0.5 µL，可以分别取5 µL的前后引物提前混匀，需要使用时吸取1 µL以减少误差；原料包括dNTPs、Taq酶等，可以使用标记技术在引物的5’端加入一个标签以便后续的辨别。）
5.PCR扩增反应设置
（1）初始变性：95 ℃下进行初始变性，时间一般设为2-10 min，用于完全变性模板DNA，使双链DNA解开为单链。
（2）循环步骤（实验中设置了45个循环）：
变性：每个循环开始时在95 ℃下进行30 sec-1 min的变性，使得模板DNA再次解开。
退火：退火温度一般设定在55 ℃左右，时间为30 sec-1 min。此时引物与模板DNA结合，温度可以根据引物的Tm值（熔解温度）进行调整。
延伸：72 ℃下进行延伸，Taq DNA聚合酶在此温度下最为活跃，扩增片段的长度决定延伸的时间，一般是每千碱基对1 min。
（3）终末延伸：在最后一次循环后，通常会设定72 ℃延伸5-10 min，以确保所有的DNA片段都完全延伸。
（4）保温：PCR完成后，反应管可以在12 ℃保温，直到取出样品进行下一步分析。
| 初始变型 | 变性 | 退火 | 延伸 | 终末延伸 | 保温 |
温度/ ℃ | 95 | 95 | 60 | 72 | 72 | 12 |
时间/ min | 10 | 0.5 | 0.5 | 1 | 5 | - |
注：变性、退火、延伸三步会进行45个循环
6.电泳检测
（1）准备琼脂糖凝胶：根据产物的大小，选择适当浓度的琼脂糖（一般为1-2 %）。加热融化后倒入电泳槽内，待凝固后上样。
（2）样品上样：将PCR产物与上样缓冲液混合后，加入到琼脂糖凝胶的泳道中。确保每个样品都有单独的泳道，同时加上DNA Marker、阳性对照和阴性对照，用于后续产物的判断。（阳性对照需要取已经检测成功的DNA样品作为对照组，阴性对照不需要加DNA，其他的试剂正常加入，并用纯水补足体积。）
（3）电泳运行：通常使用100-120 V电压运行电泳，时间大约为30 min-1 h，具体时间视凝胶大小和样品数量决定。
（4）紫外线下观察：使用染料（如EB或SYBR Green）染色后，在紫外灯下观察条带。理想情况下，扩增出的条带应该出现在目标长度的位置。
（5）污染检测：阴性对照出现条带，意味着实验污染，需要考虑是否重新进行；阳性对照未出现条带没有，意味着电泳阶段出现问题。
7.DNA片段纯化
先前PCR的样品根据电泳结果的条带选择进行下一步提纯，将选好的样品的3个重复进行混合
（1）向样品中加入3倍体积的DC缓冲液，如果所需的DC缓冲液体积小于100 μL，加入100 μL的DC缓冲液。轻轻涡旋混合样品。（实验中的PCR样品体积为25 μL，将3个重复混合后体积为75 μL，理论上应该加入3倍体积的缓冲液，实际上加入150 μL的缓冲液是足够的。）
（2）先将分离柱放入收集管中，再将涡旋完成的液体加入分离柱中，以12000 rpm的转速离心1 min，弃去流出液。（为了提高DNA的回收率，将流出液转移到离心柱中并再次离心。）
（3）向分离柱中加入700 μL的WB缓冲液。以12000 rpm的转速离心30 sec。弃去流出液，并再重复一次上述操作。（700 μL的液体加入分离柱中可能会溢出，可适量少加一些，实验中加入680 μL的缓冲液。确保已将瓶签上指示的100%乙醇体积加入WB缓冲液中。）
（4）将离心柱放回收集管中。以12000 rpm的转速离心2 min。（建议使用新的收集管或剪掉盖子并灭菌的1.5/2.0 mL的离心管。离心完成后可以打开分离柱的盖子使滤膜上残留的乙醇挥发。）
（5）将分离柱放入一个新的干净的1.5 mL管中。向滤膜中心加入25-100 μL的洗脱缓冲液或灭菌水。在室温下静置1 min，以12000 rpm的转速在室温下离心1 min以洗脱DNA。（洗脱缓冲液或灭菌水应事先加热到60 ℃可以提高洗脱效率，加入缓冲液时可分两次加入，每次加入推荐体积的一半，离心后再加另一半再离心一次，可以确保洗脱缓冲液的温度足够。）
（6）纯化完成后将DNA样品吹打混匀后，检测浓度。
